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股票代码为（300404）创立于2002年，2015年在深圳创业板上市，是一家为海内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包效劳(CRO)的型高新技术企业，同也提供药品上市许可持有人(MAH)效劳。
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威廉希尔williamhill医药始终坚持“老实、守信、专业、权威”的经营理念，截至2020年，公司累计为客户提供临床研究效劳800余项，基本涵盖了药物治疗的各个专业领域;累计完成临床前研究效劳500多项。经过近二十年的生长，威廉希尔williamhill医药在技术实力、效劳质量、效劳规模、营业收入、团队建设等方面都已跻身我国CRO公司的领先位置，成为我国本土大型CRO公司的龙头企业。
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公司新闻
袁来如此｜大分子生物剖析概论（九_上）：LBA要领的要害试剂及其稳定性
作者： 时间：2021-06-15 来源：

本文为系列文章《大分子生物剖析概论》的第九篇，旨在凭据已宣布的文献资料，介绍大分子生物剖析中对要害试剂的治理。


由于内容篇幅较长，本文将接纳上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州威廉希尔williamhill医药微信民众号打造的科普学术专栏，内容均为威廉希尔williamhill医药子公司深圳博瑞副总经理袁智博士原创。

1.导论
配体结合式测试要领（ligand binding assays, LBA）广泛地用于测定生物药在动物和人体体液中的浓度，从而评估其药代动力学、免疫原性以及与疾病相关的生物标记物。
是而这些测试要领的基础则是试剂，LBA要领的特异性、选择性和灵敏度都取决于这些试剂。
受药物的应用、开发阶段、业务和资源的影响和限制，LBA试剂的多样性及其应用，演进出多样化的治理要领。例如，非临床毒理学（TK）和临床药代动力学（clinical PK）的剖析任务可能类似 ；但对用于临床检测要领，随着新药项目通过临床开发的差别阶段，需要对试剂的多个批次变革及其恒久存储的稳定性进行治理。
虽然没有一个适合所有状况的应对要领，治理试剂生命周期的努力往往分为两类：（1）对大宗使用的某一个批次的试剂，其存储稳定性和物流将是主要问题 ；（2）如果使用小批次，批次更改的治理将是主要问题。业内已然认识到，某些试剂至关重要，其变革会显著地改变或削弱使用它们的测试要领的性能。对要害试剂的控制是包管LBA测试要领的质量和效能恒久一致的基础。
尽管目前的监管指南为PK和免疫原性测试要领的验证提供了很是具体的指导，但一般没有就要害试剂的生命周期的许多方面提供足够的指导，包括试剂的稳定性。美国FDA和欧洲药品治理局（EMA）宣布的生物剖析要领的指南只是提供了一些与要害试剂相关的关注点。在日本，关于LBA的指南草案现已果真审议。巴西、中国和印度则没有任何相关指南。已宣布的指导文件和白皮书对要害试剂的治理大多只是平常而谈，在如何治理不绝变革的要害试剂方面缺乏通用的实际操作指南：包括重要和次要批次更改、文档纪录、测试试剂的稳定性及其性能标准和批次间的连续性。因此，整个行业需要一个统一的要领，以提高一致性，并基于健全的科学和监管原则作出相关决策。
经过研究有关LBA要害试剂的全球指南和文献，本文总结出如下共识和最佳做法供讨论和实施：凭据经验和研究已宣布的文献，试剂需要在测试要领的生命周期的配景下加以考虑和治理。特别是，对一个要害试剂的表征，关于最初选择该试剂和在该测试要领的整个生命周期内有效地供应这个要害试剂，很是重要。
以下主要关注四个方面：
? 要害试剂的纪录文档
? 内部要害试剂与商用试剂的异同
? 要害试剂的更换
? 要害试剂的稳定性。
本文不计划考虑的议题包括参比试剂（reference standards）和内标（internal standards），基于细胞的PK测试要领和抗药物抗体（ADA）检测所需的样本基质以外的基质。
总体而言，关于要害试剂治理保存着多种做法的结论，在某些领域形成了高度共识。值得一提的是，相关视察结果标明，有关文档纪录的监管指南有纷歧致之处，特别是关于批次变换，只有约 50% 的规则指南具有解决批次变换的程序。大大都被视察者体现拥有要害试剂的生产程序，但没有逾期后有效期再延长的程序。
2.建议和最佳做法

要害试剂的界说

虽然在某些情况下，测试要领的任何组成身分对其性能都可能至关重要，但对任何特定测试要领的要害试剂都需要爆发一个准确界说。难以生产、替换、获取或取代的试剂可被视为稀有要害试剂 ；相反，更通用的试剂，如抗轻链或重链抗体，在某些检测中也可能至关重要。免疫捕获与LC-MS结合的测试要领可能需要将捕获抗体视为要害试剂，纵然是测试缓冲液或阻断试剂也可能对ADA检测的性能至关重要。如果需要将某个试剂界说为要害试剂，就需要主动地治理试剂的可及性和可重复性，应当通过制定书面的相关程序，用以界说某些试剂为要害试剂，并在整个测试要领的生命周期内治理这些试剂。
虽然大大都监管机构尚未界说要害试剂，但确实讨论了LBA相关试剂的要害性质。2001年宣布的FDA《生物剖析要领验证的行业指南》中将一些试剂界说为重要和要害（key and critical），并概述了在测试要领的整个生命周期中治理这些试剂的各个方面，包括交叉反应性（cross-reactivity）、贮存条件的界说、稳定性评估以及当批次改变时，评估抗体和标记了的被剖析物（示踪剂，tracer）的性能，都标明了这些试剂的要害性质和是需要评估的。
这些评估的需求可以很容易地扩展到其它的LBA试剂。2011年EMA生物剖析要领验证指南支持并拓宽了2001年FDA指南中的要害/要害试剂的看法。这些指南认识到测试要领的特异性是由所使用的试剂决定的，对要害试剂的控制关于测试要领的质量和恒久坚持其效能是至关重要的，监管机构和一些文献都提出将某些试剂确定为要害试剂。
本文建议界说以下要害试剂：看待测物（analyte）特异性的LBA剖析试剂通常被视为要害试剂（抗体，多肽，卵白质，耦合物（标记），作为试剂的药物和ADA试剂（阳性和阴性比照品）。EMA指南将要害试剂界说为"...结合试剂（binding reagents），例如，结合卵白、aptamer、抗体或耦合后的抗体）和那些含有酶活性域，对测定结果有直接影响的试剂......"。生物剖析界同意并扩大这一界说，以包括多肽，如受体或配体及它们的片段。监管指南很是明确地说明了，关于PK标准品（PK reference standards），需要如何作为标准品进行控制和评估。然而，PK标准品也可以成为一个要害的试剂，无论是在免疫原性照旧靶标生物标记物的检测中（通常是在耦合后）。
生物标记物的校准物（Biomarker calibrators）通常远不如药物标准品（drug reference standards）的表征充分。因此，批次变革更难于控制，并且往往得不到来自认可源头（例如，US Pharmacopeial Convention）的校准物。虽然生物标记物校准物不在本文讨论的规模内，但可以总结性地指出，关于生物标记物校准物的具体指南通常都缺乏，因而在预期做法与实际操作之间保存很大差别。

3.要害实际的表征（Characterization）和认证（Qualification）
要害试剂的质量是稳健地开发测试要领所必须的基本组成部分。测试试剂是凭据它们看待测物（the analyte of interest）的特异性和样本基质以及其它试剂的交叉反应特性而开发和选择的。在要领开发之前和期间，可以通过多种方法测试这些试剂的特异性和交叉反应性。理解选择这些试剂的方法、原因以及性能，关于选择和认证新批次的试剂（如果需要的话）是很是重要的。
临床和实验室标准研究所的指南强调需要对试剂进行表征，并提供了要害特性的指导。一旦测试要领开发完成并确定了要害试剂，就可以界说重新供应（resupply）要害试剂的危害。例如考虑庞大的免疫战略。关于商业来源的试剂，稀缺性（rarity）是主要挑战（例如，简单供应商/供货商，细胞株的可及性） ；关于内部试剂，纯化和耦联的庞大性或是挑战可能。监管指南指出，要害试剂的表征和认证应针对预设的用途，可是所需要的试剂表征的水平，对给定的测试要领而言，差别可能很大。
因此，本文不详描述试剂表征和初始认证的评估规模，而是仅仅建议：进行足够的表征，以便在生成新批次时，实现某种形式的一致性（consistency）和历程控制（process control），并且这种认证是有据可查的。试剂特征包括但不限于：身份(identity)、来源、纯度、浓度（或滴度）、结合亲和力（bindingaffinity）、等型（单克隆/多克隆抗体）、分子量、特异性（specificity）、成合比（incorporation ratio）和聚合水平(aggregation level)。若干文献详细讨论了要害的试剂表征和测试要领，药物开发的阶段也是投资试剂表征的水平和规模的考虑因素之一。
4.要害试剂的采购
考虑获得足够数量的要害试剂，无论是内部制备的，或是从商业来源采购的，最好是能够满足整个临床研究的需要。试剂可以在内部生产，也可以作为定制生产或现成的试剂从商业来源获得。然而，选择要害试剂的可靠来源，这个看起来显然很简单的任务，却并非易事。这可能需要仔细计划、考虑利弊以及进行尽职视察。

内部生产试剂

可获得内部定制生产的试剂，以适应所设计的测试要领; 可以对其预设的用途，进行大规模表征，可以自界说剖析证书（CofA），爆发稳定性数据等。更重要的是，可以监测和控制批次间的变异性（特别是在标记卵白质时）。别的，对内部生产的试剂的管控，可能允许更好地进行生命周期治理。然而，内部生产试剂需要熟练的人员以及大宗的投资，以建立一个试剂生产的基础设施和预先计划的生产历程。

商业生产的试剂

商用试剂广泛地用于种种花样的LBA的开发。商业试剂的主要优势包括：可以从多个供应商处立即获得种种试剂，通常对预设用途做过表征并附带有某种 CofA。别的，可以从多个来源获得种种检测试剂（标记过的卵白），并在其中找到，对某个特定测定要领而言，性能卓越的检测试剂。
除了现成的试剂外，许多供应商还提供定制生产和特定试剂的表征。这种方法的主要利益是：信誉良好的测试试剂的制造商通常拥有完善的生产设施，技术能力和知识储备，可以有效地支持试剂的生产和应用。别的，它们还可以为最终用户提供精彩的支持，包括定制试剂的生成和耦合以及解决应用中泛起的问题。
然而，使用商业试剂并非没有挑战。有几个与商业试剂有关的问题，可能需要仔细考虑。其中一些列在表1中，包括缺少试剂的稳定性数据、缺少可用的试剂规格/批次放行的验收标准（尽管某些供应商可能会应客户的要求提供该标准）以及缺乏相关试剂的其他基本信息。
最大的挑战是未标记和标记的试剂批次之间的变异性。在使用多个批次试剂的恒久研究中，这可能会造成桥接数据的困难。生产商改变要害试剂的批次并不稀有，例如用于生产偶联体的多克隆抗体池，它们可能切合批次放行的规范，但可能对最终用户组成重大危害。此类变换很可能无法实时转达给最终用户。别的，特定试剂的生产可能会终止，并且不会提前通知客户。

关于要害试剂采购的建议

鉴于商业试剂来源于能力（雄厚的技术，支持性文件的实力，有提供多批次产品的能力）各不相同的多个供应商，谨慎的做法是进行尽职视察和可行性评估，以选择可靠的试剂和供应商。无论试剂是在内部生产照旧从商业来源获取，了解试剂具体特征的需求都是一样的。与供应商建立密切关系是很是有益的，这有助于扩展技术支持的规模，以提高故障排除率，解决试剂相关问题，实时获取有关试剂批次变革的信息和确保特定批次的恒久供应。别的，如果只有一家要害试剂的供应商，则建议考虑建立某种条约关系，这些条约关系可以给用户预警产品更改或生产停止。下面列出了值得考虑的若干的要点：
& 来自差别供应商的相同浓度单位的重组卵白和多肽在一个测试系统中可能有差别的体现。因此，选择并保存足够数量的试剂以满足恒久需要是有益的。在某些情况下，如果已在验证期间确定一个校正因子，或者已生成能支持该校正因子的实验数据，则可考虑使用校正系数来赔偿内容和比例过失（content and proportional errors）。
& 供应商通常拥有质量控制/质量包管和批次放行的流程。尽管通常不可审核这些流程，但在某些情况下，可能有时机对供应商的设施进行QA审计。
&  通�？梢酝ü岢鎏囟ㄇ肭罂梢曰竦猛ǔ２慌阃攀约撂峁┑奈募ɡ�，与试剂的表征，稳定性，批次放行规范，等，相关的文件）。
& 商业化生产的预涂层固相支持物件，如电化学发光和ELISA板材和珠子可能需要被视为要害试剂。应该建立和纪录与这些要害试剂相关的内部流程，如批次验收测试，以确保板材的涂层均匀，尤其是在使用条带的情况下。关于使用商业试剂构建的内部生物标记物的检测要领，应使用含有内源性被剖析物（endogenous analyte）的混淆（pooled）生物基质（如血清/血浆）作为QCs，用来监测差别批次的商业试剂的性能。
& 解释生产商的失效期数据，作为该试剂的测试/再测试的依据，因为该试剂在凌驾"到期日期"后，可能仍适用于预期用途。请参阅“试剂稳定性”部分，以获得相关的详细指导。

表1.从内部和商业来源获得的试剂的有关注意事项




5.要害试剂的更换
用于配体结合测试要领的试剂通常由生物生产历程生产，而不是一个完全可控的合成历程。这将导致差别批次之间的可变性和异质性。卵白生产出来之后，通常有纯化和标记办法，这更增加了产品的庞大性。别的，通常需要在很长的一段时间里，使用这些测试要领，以支持一个药物的整个生命周期，这意味着可能需要多个批次的试剂来支持恒久的测试。
为了尽量减少批次之间的可变性，必须拥有规范良好，并且前后一致的试剂生产流程 ；也必须凭据相关的生产计划和标记程序(labeling procedures)生产，并且完整地纪录整个流程。
可是，计划（protocols）和程序（procedures）的详细水平往往不对适（见最近的例子见15）。所以必须认识到：对生产程序的描述越详细，试剂生产的可重复性就越大，更换要害试剂可能是面临的最重大的挑战之一。在2001年生物剖析要领验证指南中，FDA指出“...如果更改要害试剂，则可能需要重新优化或验证该测试要领”。别的，EMA指南划定，当试剂批次更改时，必须确认测试要领的剖析效能，“以确保与原始批次或上一批次的试剂相比，该要领的效能不会改变”。
对试剂的任何操作都代表该试剂成为一个新的批次（包括稀释）。O'Hara等人将试剂或某个批次试剂的更改归类为需要差别评估的级别：即主要和次要的更改。这样的评估是由科学驱动。建议事先确定一套明确的绩效评估要领和验收标准，并详细纪录验收标准和相关实验。相关文件可以是指导试剂更改的标准操作程序（SOP），也可以作为最终要领报告的一部分。
事实上，并非所有生物剖析实验室都有相应的程序或者正式的SOP，用以治理试剂批次的变换。在某些情况下，认证可能只是使用新试剂批次的单个测试运行，或者在同一运行中使用新和旧试剂的单个测试运行。与旧批次比较是有用的，但不是绝对需要的，因为在许多情况下，旧（或原始）批次可能已经用完。某些实验室拥有界说更明确的、用于批次变换的测试要领验证程序。在某些情况下，对新试剂的界说也可能保存一些差别，例如从同一原始质料生产出来的新批次。
业界最初认为，新批次试剂的认证和稳定性测试的接受标准应包括最大的仪器响应。然而，对基于仪器响应的信号控制图（signal control charts）的效用有差别意见。因此，需要关注下列事项：用于生成检测信号的剖析平台 ；比较同一仪器随时间而获取的信号的能力 ；比较差别仪器的所爆发的信号的能力以及情况温度等变量的影响。

关于更换要害试剂的建议

本文建议在一个功效性测试中测试新试剂，并接纳预先验设立的检考试收标准。下面提出了认证这些要害试剂的两级式要领，测试的规模是由该试剂的变革水平，或者这些变革可能爆发的影响水平所驱动的。在测试中，通常使用外加待测物的QCs来界说该要领的效能，但关于生物标记物的测定，可能需要包括含有内源性待测物（endogenousanalyte）的，基于真实样本的QCs，以确保commutability（可变性）。

细微变革

试剂的细微变革被界说为预期对测试性能影响极小的试剂改变 ；因此可以实施相关改变，而不会对数据生成爆发任何有害影响。这种细微变革的例子是一个从以前认证过的原液生长而来新的试剂批次，如：从相同动物的多克隆血清做的新一次亲和纯化的产品 ；或使用相同批次的卵白质做的新一次耦合反应，而该耦合历程已经被证明是受控良好的。用于制备新一个试剂批次的历程应与用于生成原始批次的历程相同。第一个测试级别包括所有试剂的资格认证计划中所共有的测试（图1）。
& 推荐测试运行一次，包括3个级别的QC样品，但更理想的是包括定量下限和上限在内的，总共5个QC，因为定量规模的两个极端是PK和生物标记物测试要领最软弱的地方。关于免疫原性测试，应包括3个级别的QC样品，包括接近切点的阴性和低阳性比照样品。
& 如果同时更换多个试剂，则可以使用同一检测要领一起测试并认证这些试剂。建议执行多个测试运行，以提高对结果的信心，并且最洪流平地降低接受假阳/阴性结果而导致的危害。可是，如果一次只更换一个试剂，则一次运行可能就足够了。
& 建议在可能的情况下，并行地测试目今试剂与原始试剂。与原始批次的比较在监视或控制测定要领性能的漂移方面很是有用。可是，在没有可比较批次的情况下，对最大信号和/或 QC信号的监控就变得越发重要了。
& 一旦从适当的认证测试生成了可接受的数据，其结果应作为能够接受试剂更换的纪录，无需再做进一步认证。
& 在结果不切合接受标准的情况下，可能需要进一步单独测试以确定失败的原因。单次失败可以通过重新制备一次标准样品和QCs，并重新测试来调解。然而，重复的失败至少会标明需要制备一个新试剂批次，并可能重新优化该测试要领。重复的失败也可能标明需要生产一批新的原始试剂 ；但这将被视为一个重大变换。
& 建议监控QC样品的最大仪器响应，但仅仅作为判断测试要领性能的一个工具，而不是作为接受标准。随着在较长连续时间内或较大研究中收集，整理更多的数据，跟踪QC最大仪器响应趋势的价值会随之增加。

重大变换

这是最高的试剂认证级别，主要适用于在一个试剂的原始来源枯绝，需要更换要害试剂的情况。此时，将确定新的供应商，表征新的试剂，并证明新试剂的测试性能。
重大变革的例子包括重新动物获得的抗体批次、用于单克隆抗体生产的新克隆，或用于生产重组物料的新细胞系。其中每个变换都预期需要广泛的重新认证。为了维持测试要领的性能，一个不太明显，但有时是必不可少的任务，可能是接纳一个新批次的阴性比照品，这关于免疫原性测试的关系特别重大。除接纳对试剂细微变换时的认证建议外，对测试试剂的重大变换也应考虑接纳以下行动（图1）：
& 应至少执行三次测试运行，以表征新试剂的测试性能。
& 在多次运行中，并行测试新试剂和原始试剂。如果新试剂不切合测试接受标准和/或其测试性能爆发变革，但试剂仍然适适用于测试目的，则新试剂可能是可以接受的，但需要更广泛的认证，如部分要领验证。
& 还需要其他数据来描述和正确纪录新试剂对测试要领参数的全面影响。

图1.要害试剂治理流程的总结


10.特别声明

本文如有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有引用的原始信息和资料均来自已经宣布学术期刊, 官方网络报道, 等果真渠道, 不涉及任何保密信息。参考文献的选择考虑到多样化但也不可能完备� ＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦�。
参 考 文 献
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